УДК 57.017.8 Способы питания
УДК 57.042 Внешние факторы в целом. Комбинированное воздействие нескольких факторов
Черноплодная рябина содержит широкий спектр биологически активных веществ, обладающих потенциальной геропротекторной активностью. Ранее нами обнаружено, что этанольный экстракт плодов черноплодной рябины ×Sorbaronia mitschurinii (ABE) оказывает положительный эффект на продолжительность жизни особей Drosophila melanogaster при кратковременном воздействии (две недели). В настоящем исследовании оценивали эффекты ABE на целостность интестинального барьера Drosophila melanogaster. Данный показатель является маркером старения многих модельных организмов (нематоды, рыбы и дрозофилы) и его нарушение коррелирует с приближением возраст-зависимой гибели. В качестве индикатора проницаемости кишечного барьера использовали синтетический синий пищевой краситель Brilliant Blue FCF. Установлено, что ABE, применяемый до возраста двух недель, не оказал значительного воздействия на целостность кишечного барьера у самцов и самок Drosophila melanogaster. Однако обработка ABE в возрасте четырех-пяти недель привела к трехкратному снижению количества самок (p < 0.05) с нарушенной целостностью кишечного барьера на восьмой неделе жизни по сравнению с одновозрастными необработанными самками Drosophila melanogaster. Таким образом, обработка мушек в среднем возрасте экстрактом плодов черноплодной рябины приводит к отсрочиванию возникновения возраст-зависимых нарушений целостности интестинального барьера Drosophila melanogaster.
черноплодная рябина, геропротектор, Drosophila melanogaster, интестинальный барьер
Введение
У всех живых организмов существует множество различных барьеров как внутренних, так и внешних (например, кожный, кишечный, респираторный), защищающих от воздействия факторов окружающей среды. Сохранение целостности барьеров в течение жизни является одним из основных критериев здоровья и долголетия [1]. Ранее было установлено, что возрастное снижение уровня тканевого гомеостаза может приводить к нарушению барьерных функций организма и, в частности, к повреждению кишечного барьера и дальнейшим воспалительным процессам, в результате которых снижается качество жизни и повышается вероятность развития различных заболеваний, ускоряющих возраст-зависимую гибель организма [2–6].
В состав кишечного барьера входят микробиота, слизистый слой и физический барьер, представленный эпителиальными и иммунными клетками [1, 7]. Для ряда модельных организмов, включая нематод, рыб и дрозофил, нарушение целостности кишечного барьера представляет собой маркер старения [1, 4, 8].
Ранее установлено, что некоторые фенольные соединения растительного происхождения оказывают защитное действие на эпителий кишечника модельных организмов in vivo [5, 9, 10]. Например, симвастатин, ресвератрол и куркумин снижали воспаление слизистой оболочки тонкой кишки у мышей, инфицированных Toxoplasma gondii [11]. Экстракт клюквы в концентрации 200 мг/кг, вводимый ежедневно через зонд, уменьшал воспалительные процессы в кишечнике мышей, получавших корм с высоким содержанием жира и сахарозы [12]. Кроме того, флавоноиды цитрусовых оказывают многостороннее благоприятное действие на кишечный барьер за счет антиоксидантных, противовоспалительных и иммуномодулирующих свойств, а также оздоровления микробиома и метаболома [3]. В то же время актинидин (основной аллерген киви) оказывал негативный эффект на in vivo (мыши) и in vitro (культура клеток Caco-2 ) модели кишечного барьера [13]. Интересно, что летальное действие растительного алкалоида колхицина обусловлено апоптотической гибелью клеток желудочно-кишечного эпителия, вызывающей нарушение целостности кишечного барьера и последующий эндотоксиновый шок [14]. Таким образом, различные растительные соединения могут оказывать как положительный, так и отрицательный эффект на функциональное состояние кишечного барьера.
Черноплодная рябина обладает широким спектром биологически активных веществ (фенольные кислоты, флавоноиды, антоцианы, проантоцианидины) [15]. Ранее, на основании анализа данных литературы, нами установлен высокий геропротекторный потенциал экстрактов Aronia melanocarpa [15]. Экспериментально было обнаружено, что кратковременная обработка имаго D. melanogaster в возрасте с четырех по шестую неделю этанольным экстрактом плодов ×Sorbaronia mitschurinii (ABE) вызывает увеличение медианной (до 5 %) и максимальной (до 9 %) продолжительности жизни. При этом обработка мух экстрактом в первые две недели жизни или на протяжении всей жизни оказывала негативный эффект на медианную и максимальную продолжительность жизни (снижение до 9 %) [16].
Кроме того, было изучено влияние различных экстрактов аронии на проницаемость кишечника на моделях in vivo и in vitro. Valdez с соавт. [17] показали, что порошок полифенолов аронии (0.5–10 мг/мл) улучшает барьерную функцию кишечника на модели эпителиальных клеток кишечника Caco-2. Paulrayer с соавт. [18] обнаружили защитный эффект экстракта черноплодной рябины в концентрации 200 мг/кг на вызванное этанолом повреждение желудка у крыс.
Поскольку функциональное состояние кишечного барьера взаимосвязано с процессом старения, цель настоящей работы состояла в оценке эффектов этанольного экстракта плодов черноплодной рябины на целостность интестинального барьера у D. melanogaster.
Материалы и методы
Растительный материал и экстракция. Плоды черноплодной рябины ×Sorbaronia mitschurinii были собраны в летний период (август 2020 г.) в Ботаническом саду (Научная коллекция живых растений № 507428) Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, Россия). Ягоды предварительно замораживали при температуре -20 °C. Для приготовления экстракта плоды измельчали и центрифугировали для получения супернатанта. Полученную массу смешивали со смесью на основе глины и повторно центрифугировали. Глиняную смесь получали смешиванием термообработанной глины (Терракот, Россия) с 0,1 М соляной кислотой. Полученную надосадочную жидкость сливали и смешивали сорбент с экстрагентом: 1 %-ным раствором концентрированной соляной кислоты в 95 %-ном этаноле. Полученный раствор центрифугировали, затем этанол из экстракта упаривали на вакуумно-роторном испарителе ИР-1М (Химлаборприбор, Россия) при 35 °C. Экспериментальные концентрации экстракта ягод аронии (ABE) были приготовлены из полученного этанольного экстракта путем разбавления 96 %-ным этанолом.
Условия содержания Drosophila melanogaster. В экспериментах использовали линию дикого типа Canton-S (Cs, #64349, Блумингтон, США). Мух содержали в камере постоянного климата Binder KBF720-ICH (Binder, Германия) при +25 °C и относительной влажности 60 % при режиме освещения 12 ч свет: 12 ч темнота. Питательная среда, на которой жили мухи, содержала воду – 1 л, кукурузную муку – 92 г, сухие дрожжи – 32.1 г, агар-агар – 5.2 г, глюкозу – 136.9 г. Для предотвращения роста плесени и бактерий на 1 л среды добавляли 5 мл 10 %-ного раствора нипагина (метил 4-гидроксибензоат, Merck, США) в этаноле и 5 мл пропионовой кислоты (Merck, США). Раствор ABE в 96 %-ном этаноле с концентрациями 0.1, 1 и 5 мг/мл наносили непосредственно на поверхность свежей застывшей среды в объеме 30 мкл. На поверхность среды контрольных вариантов наносили 30 мкл 96 %-ного этанола. Далее поверхность среды просушивали под вентилятором.
Обработка экстрактом аронии. Обработку экстрактом плодов аронии имаго мух D. melanogaster линии Cs проводили в разном возрасте. Одна группа подвергалась обработке ABE в течение двух недель после вылупления имаго (обозначенного как «1–2»), а другая группа получала ABE в возрасте от четырех до пяти недель (обозначено как «4–5»). Обе группы до и после добавления ABE кормили контрольной средой без экстракта.
Анализ целостности кишечного барьера. Для оценки целостности кишечного барьера был использован Смурф-тест [19]. Контрольные и опытные группы содержали в течение 16 ч на пищевой среде, содержащей 2.5 % (масса / объем) синего пищевого красителя Brilliant Blue FCF (Roha Dyechem, Индия), после чего их пересаживали на стандартную среду без красителя. Учитывали долю окрашенных в синий цвет мух (Смурф-фенотип), возникающих вследствие увеличения проницаемости кишечного барьера.
Мух, получавших экстракт в первые две недели и на четвертой-пятой неделе жизни, анализировали на следующей неделе после перехода на контрольную среду. В группе 1–2 анализ проводился на третьей неделе, а в группе 4-5 – на шестой. В старом возрасте (восемь недель) анализу подвергались обе группы.
Результаты и их обсуждение
Ранее у D. melanogaster наблюдали задержку возраст-зависимого нарушения целостности кишечного барьера под воздействием вмешательств, увеличивавших продолжительность жизни (например, снижение температуры окружающей среды или диетические ограничения) и отсрочивавших появление дефектов кишечного барьера [4].
В предварительном исследовании нами обнаружено, что применение этанольного экстракта плодов черноплодной рябины в концентрациях 0.01, 0.1, 1, 2.5, 5 и 10 мг/мл на протяжении всей жизни D. melanogaster не оказывало отрицательного воздействия на проницаемость кишечного барьера в возрасте двух, шести и восьми недель [16].
В настоящей работе мы изучили последствия кратковременного воздействия (две недели) этанольного экстракта плодов черноплодной рябины на функциональное состояние кишечного барьера плодовой мушки. Показано, что ABE не оказал влияния на состояние кишечного барьера при обработке мух в первые две недели жизни. Однако обработка мух в возрасте четырех-пяти недель ABE в концентрациях 0.1, 1 и 5 мг/мл привела к трехкратному снижению (p < 0.05) частоты появления Смурфов у особей женского пола на восьмой неделе жизни по сравнению с необработанным контролем (таблица). Таким образом ABE оказывает защитный эффект на функциональное состояние кишечного барьера. Полученный нами эффект указывает на положительное действие экстракта ягод аронии на поддержание тканевого гомеостаза. Ранее [4] было доказано, что большое значение в поддержании тканевого гомеостаза играет активность коактиватора транскрипции dPGC-1, являющегося ключевым регулятором энергетического метаболизма, включая митохондриальный биогенез и дыхание, и который вовлечен в поддержание стволовых клеток. Кроме того, установлено, что разные сорта крестоцветных овощей (Brassica oleracea), а именно экстракты брюссельской капусты и брокколи, защищают кишечный барьер D. melanogaster от окислительного повреждения паракватом за счет активации транскрипционного фактора Nrf2, регулирующего экспрессию генов детоксикации и антиоксидантной защиты [20]. Напротив, на моделях in vivo (Drosophila) и in vitro (клетки Caco-2 и HT29-MTX ) было обнаружено, что вред диеты с высоким содержанием сахара обусловлен, в частности, повышением кишечной проницаемости за счет снижения активности кишечной щелочной фосфатазы, выступающей фактором защиты слизистой оболочки кишечника [21]. Таким образом, результаты наших исследований согласуются с данными литературы о благоприятном действии растительных полифенолов на проницаемость кишечного барьера.
Заключение
Таким образом, в настоящем исследовании мы обнаружили, что этанольный экстракт плодов черноплодной рябины, кратковременно (две недели) применяемый в пострепродуктивном периоде (в возрасте четырех недель) D. melanogaster в три раза сократил долю самок с нарушением целостности кишечного барьера в возрасте восьми недель. При этом обработка экстрактом в первые две недели жизни не привела к статистически значимым эффектам на целостность кишечного барьера у самцов и самок плодовых мушек в различном возрасте (три и восемь недель). Для выявления механизмов защитного действия экстракта ягод черноплодной рябины на целостность кишечного барьера нам необходимы дальнейшие исследования с применением методов молекулярной биологии.
1. Hallmarks of Health / C. López-Otín, G. Kroemer // Cell. - 2021. - Vol. 184, N 1. - P. 33-63.
2. Intestinal permeability - a new target for disease prevention and therapy / S. C. Bischoff, G. Barbara, W. Buurman, T. Ockhuizen, J. D. Schulzke, M. Serino, H. Tilg, A. Watson, J. M. Wells // BMC Gastroenterol. - 2014. - Vol. 14 - P. 189.
3. Citrus flavonoids and the intestinal barrier: Interactions and effects / M. Wang, H. Zhao, X. Wen, C. T. Ho, S. Li // Compr Rev Food Sci Food Saf. - 2021. - Vol. 20, N 1. - P. 225-251.
4. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog / M. Rera, S. Bahadorani, J. Cho, C. L. Koehler, M. Ulgherait, J. H. Hur, W. S. Ansari, T. Lo, Jr., D. L. Jones, D. W. Walker // Cell Metab. - 2011. - Vol. 14, N 5. - P. 623-634.
5. Dietary polyphenols can modulate the intestinal inflammatory response / B. Romier, Y.-J. Schneider, Y. Larondelle, A. During // Nutrition Reviews. - 2009. - Vol. 67, N 7. - P. 363-378.
6. Impaired Intestinal Permeability Contributes to Ongoing Bowel Symptoms in Patients With Inflammatory Bowel Disease and Mucosal Healing / J. Chang, R. W. Leong, V. C. Wasinger, M. Ip, M. Yang, T. G. Phan // Gastroenterology. - 2017. - Vol. 153, N 3. - P. 723-731.e721.
7. The Intestinal Barrier Dysfunction as Driving Factor of Inflammaging / E. Untersmayr, A. Brandt, L. Koidl, I. Bergheim // Nutrients. - 2022. - Vol. 14, N 5. - P.
8. Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death / E. Dambroise, L. Monnier, L. Ruisheng, H. Aguilaniu, J. S. Joly, H. Tricoire, M. Rera // Sci Rep. - 2016. - Vol. 6 - P. 23523.
9. Exploring the effects of phenolic compounds to reduce intestinal damage and improve the intestinal barrier integrity: A systematic review of in vivo animal studies / B. A. Sandoval-Ramírez, Ú. Catalán, A. Pedret, R. M. Valls, M. J. Motilva, L. Rubió, R. Solà // Clin Nutr. - 2021. - Vol. 40, N 4. - P. 1719-1732.
10. Potential of Plant-sourced Phenols for Inflammatory Bowel Disease / H. T. Xiao, B. Wen, X. C. Shen, Z. X. Bian // Curr Med Chem. - 2018. - Vol. 25, N 38. - P. 5191-5217.
11. Anti-inflammatory effects of resveratrol, curcumin and simvastatin in acute small intestinal inflammation / S. Bereswill, M. Muñoz, A. Fischer, R. Plickert, L. M. Haag, B. Otto, A. A. Kühl, C. Loddenkemper, U. B. Göbel, M. M. Heimesaat // PLoS One. - 2010. - Vol. 5, N 12. - P. e15099.
12. A polyphenol-rich cranberry extract protects from diet-induced obesity, insulin resistance and intestinal inflammation in association with increased Akkermansia spp. population in the gut microbiota of mice / F. F. Anhê, D. Roy, G. Pilon, S. Dudonné, S. Matamoros, T. V. Varin, C. Garofalo, Q. Moine, Y. Desjardins, E. Levy, A. Marette // Gut. - 2015. - Vol. 64, N 6. - P. 872-883.
13. Kiwifruit cysteine protease actinidin compromises the intestinal barrier by disrupting tight junctions / M. M. Grozdanovic, M. Čavić, A. Nešić, U. Andjelković, P. Akbari, J. J. Smit, M. Gavrović-Jankulović // Biochim Biophys Acta. - 2016. - Vol. 1860, N 3. - P. 516-526.
14. Acute Colchicine Poisoning Causes Endotoxemia via the Destruction of Intestinal Barrier Function: The Curative Effect of Endotoxin Prevention in a Murine Model / K. Horioka, H. Tanaka, S. Isozaki, H. Konishi, M. Fujiya, K. Okuda, M. Asari, H. Shiono, K. Ogawa, K. Shimizu // Digestive Diseases and Sciences. - 2020. - Vol. 65, N 1. - P. 132-140.
15. Black chokeberry (Aronia melanocarpa) extracts in terms of geroprotector criteria / E. Y. Platonova, M. V. Shaposhnikov, H.-Y. Lee, J.-H. Lee, K.-J. Min, A. Moskalev // Trends in Food Science & Technology. - 2021. - Vol. 114 - P. 570-584.
16. Geroprotective effects of ×Sorbaronia mitschurinii fruit extract on Drosophila melanogaster / E. Y. Platonova, N. V. Zemskaya, M. V. Shaposhnikov, D. A. Golubev, D. V. Kukuman, N. R. Pakshina, N. S. Ulyasheva, V. V. Punegov, S. A. Patov, A. Moskalev // Journal of Berry Research. - 2022. - Vol. 12 - P. 73-92.
17. Aronia berry inhibits disruption of Caco-2 intestinal barrier function / J. C. Valdez, J. Cho, B. W. Bolling // Arch Biochem Biophys. - 2020. - Vol. 688 - P. 108409.
18. Aronia melanocarpa (Black Chokeberry) Reduces Ethanol-Induced Gastric Damage via Regulation of HSP-70, NF-kappaB, and MCP-1 Signaling / A. Paulrayer, A. Adithan, J. H. Lee, K. H. Moon, D. G. Kim, S. Y. Im, C. W. Kang, N. S. Kim, J. H. Kim // Int J Mol Sci. - 2017. - Vol. 18, N 6. - P.
19. Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila / M. Rera, R. I. Clark, D. W. Walker // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2012. - Vol. 109, N 52. - P. 21528-21533.
20. Cruciferous vegetables (Brassica oleracea) confer cytoprotective effects in Drosophila intestines / J. T. Lyles, L. Luo, K. Liu, D. P. Jones, R. M. Jones, C. L. Quave // Gut Microbes. - 2021. - Vol. 13, N 1. - P. 1-6.
21. Effect of dietary additives on intestinal permeability in both Drosophila and a human cell co-culture / M. T. Pereira, M. Malik, J. A. Nostro, G. J. Mahler, L. P. Musselman // Dis Model Mech. - 2018. - Vol. 11, N 12. - P.
