ВведениеНа протяжении многих лет съедобные растения и продукты из них активно используются в качестве основы здоровой диеты и для улучшения физиологических показателей организма [1]. Улучшающие здоровье свойства растений связаны с наличием различных групп вторичных метаболитов, особенно фитохимических компонентов, таких как фенольные соединения с многочисленными положительными биологическими активностями [2]. Наиболее важным и широко изученным свойством фенольных соединений является их защитный эффект от окислительных повреждений, вызванных свободными радикалами, что может отсрочить возникновение или облегчить протекание различных патологий и дегенеративных состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, рак, поражение центральной нервной системы, болезни Паркинсона и Альцгеймера, диабет, респираторные и аутоиммунные заболевания [3, 4]. Черноплодная рябина (×Sorbaronia mitschurinii), или арония, представляет собой листопадный кустарник, принадлежащий к семейству розоцветных. Ягоды аронии хорошо известны своим положительным влиянием на здоровье, что в основном связано с высоким содержанием полифенолов [5]. Помимо полифенолов, функциональными компонентами ягод аронии являются клетчатка и сорбит, органические кислоты, белки и липиды [6]. По сравнению с большинством овощей и фруктов, ягоды аронии содержат значительно больше полифенолов, в том числе антоцианов, проантоцианидинов, флавонолов и фенольных кислот [7, 8]. Наиболее распространенные полифенолы в ягодах аронии – это антоцианы, группа водорастворимых пигментов, ответственных за темно-фиолетовый, синий и красный цвета многих фруктов и овощей [9]. Также ягоды черноплодной рябины содержат проантоцианидины. Известно, что антоцианы и проантоцианидины обладают противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, могут защищать организм от окислительного стресса и повреждения свободными радикалами [6, 9]. Ранее было показано, что ягоды черноплодной рябины обладают потенциальными нейропротекторными свойствами. Проводили проверку эффектов потребления диетических продуктов, полученных из ягод [10–12], или применения экстрактов черноплодной рябины [13], изолированных полифенолов, содержащихся в изобилии в этой ягоде [14], а также исследования с использованием специфических соединений, например, определенные полифенолы или их метаболиты [9]. На данный момент побочные эффекты применяемых экстрактов черноплодной рябины мало изучены, вероятно проявление аллергической реакции у детей и взрослых на плоды данного растения за счет большого количества в них разнообразных биологически активных молекул [15].Болезнь Альцгеймера – наиболее распространенное нейродегенеративное расстройство, при котором происходит нарушение функций нейронов, сопровождается дефектами обучения и памяти [16, 17]. Бета-амилоид (далее – Аβ) играет ключевую роль в формировании болезни Альцгеймера [17, 18]. Нейродегенеративные заболевания обычно считаются возрастными, но они также могут поражать более молодое население [19]. В настоящее время известно, что важную роль в их развитии играет не только генетическая предрасположенность, но и факторы окружающей среды [20]. Появляется все больше доказательств того, что окислительный стресс играет центральную роль в развитии нейродегенеративных заболеваний [19, 21–23]. Поэтому актуален поиск веществ и соединений, которые могут потенциально снижать негативные воздействия окислительного стресса, а также обеспечивать защиту от дегенеративных заболеваний и старения за счет активации эндогенных систем антиоксидантной защиты и регуляции клеточных сигнальных путей. Опубликованные Afzal et al. [24] и Suresh et al. [25] систематические обзоры доклинических данных показали, что антоцианы обладают потенциальным терапевтическим эффектом при болезни Альцгеймера, снижая окислительный стресс, воспаление и накопление бета-амилоида. Также установлено, что экстракт черноплодной рябины увеличивает продолжительность жизни и снижает возрастной окислительный стресс у Drosophila melanogaster [13, 26].В связи с этим, цель настоящей работы – изучение влияния экстракта ягод черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) на дрозофилиную модель болезни Альцгеймера. Материалы и методыЭкстракцияЭкстракцию ягод проводили по методике, описанной ранее в работе [26]. Ягоды черноплодной рябины собирали в осенний период (август – сентябрь) на территории Республики Коми (Северо-Запад России). Ягоды предварительно замораживали при температуре -20 °C. Для приготовления экстракта плоды измельчали и центрифугировали для получения супернатанта, который смешивали с глиной, приготовленной на растворе 0.1 М соляной кислоты, и снова центрифугировали. Полученную жидкость сливали и смешивали с экстрагентом: 1 %-ным раствором концентрированной соляной кислоты в 96 %-ном этаноле. Полученный раствор еще раз центрифугировали, затем этанол из экстракта упаривали на вакуумно-роторном испарителе ИР-1М (Химлаборприбор, Россия) при +35 °C. Экспериментальные концентрации экстракта ягод аронии (ABE) были приготовлены из полученного этанольного экстракта путем разбавления 96 %-ным этанолом.Линии DrosophilaВ качестве модели болезни Альцгеймера использовали мух D. melanogaster со сверхэкспрессией предшественника бета-амилоида человека UAS-Aβ42 (#33769, Блумингтон, США). Особи линии UAS-Aβ42 несут в генотипе фрагмент человеческого гена предшественника бета-амилоида 42 (Hsap\APP) под контролем промотора UAS в хромосоме 2 (генотип: w[1118]; P{w[+mC]=UAS-APP.Abeta42.B}m26) [27]. Поскольку бета-амилоид 42 (Aβ42) играет центральную роль в патогенезе болезни Альцгеймера [18], сверхэкспрессия пептидов Aβ42 в нервной системе дрозофилы приводит к дегенерации нейронов в зависимости от уровня экспрессии и возраста [27].Для активации сверхэкспрессии трансгена UAS-Aβ42 у D. melanogaster использовали драйверную линию elavc155-Gal4 (#458, Блумингтон, США). В хромосому X данной драйверной линии (генотип: P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155]) встроен GAL4, который экспрессируется в нейронах под контролем промотора elav. Активация экспрессии GAL4 начинается в нервной системе эмбриона на стадии 12.Содержание линий DrosophilaМух содержали в камере постоянного климата Binder KBF720-ICH (Binder, Германия) при +25 °C и относительной влажности 60 % при режиме освещения 12 ч свет : 12 ч темнота. Питательная среда, на которой жили мухи: вода – 1 л, кукурузная мука – 92 г, сухие дрожжи – 32.1 г, агар-агар – 5.2 г, глюкоза – 136.9 г, с добавлением 5 мл 10 %-ного раствора нипагина (метил 4-гидроксибензоат, Merck, США) в этаноле и 5 мл 50 %-ной пропионовой кислоты (Merck, США).Обработка экстрактом аронииРаствор экстракта ягод в 96 %-ном этаноле с концентрацией 10 мг/мл наносили непосредственно на поверхность свежей застывшей среды в объеме 30 мкл. На поверхность среды контрольных вариантов наносили 30 мкл 96 %-ного этанола. Далее поверхность среды просушивали под вентилятором. Дрозофил кормили экстрактом на протяжении всей жизни.Анализ продолжительности жизниПосле вылупления мух разделяли по полу с помощью СО2-анестезии и переносили в пробирки (30 мух на пробирку), содержащие питательную среду с различными концентрациями экстракта. Мертвых мух подсчитывали ежедневно, а оставшихся живых мух помещали в новые пробирки со свежей средой два раза в неделю. Рассчитывали медианную и максимальную (возраст 90 % смертности) продолжительность жизни. На каждый вариант эксперимента отбирали по 100–150 особей. Эксперименты проводили в двух-трех повторностях.Статистический анализ полученных результатовДля анализа статистических различий в функциях выживаемости и средней продолжительности жизни между контрольной и экспериментальной группами использовали модифицированный критерий Колмогорова-Смирнова и логранговый критерий соответственно [28, 29]. Для оценки различий в возрасте 90 % смертности применяли тест Ванг-Эллисона [30]. Статистический анализ данных был выполнен с использованием программного обеспечения R, версии 2.15.1 (The R Foundation, США), Excel (Microsoft, США) и OASIS 2 (Online Application for Survival Analysis 2) [31].Результаты и их обсуждение Ранее был проведен анализ состава экстракта ягод аронии методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее – ВЭЖХ), который показал, что главные составляющие экстракта – дельфинидин и цианидин [26]. Дельфинидин и цианидин – антоцианидины, которые содержатся во многих ярко-сине-красных фруктах и ягодах, таких как ягоды манитобы, ягоды саскатун (ирга) [32], баклажаны [33]. Цианидин наиболее часто встречается в малине, клубнике [32] и черноплодной рябине [34], вишне [35], в кожуре яблока [36], асаи [37]. Кроме того, ягоды черноплодной рябины содержат широкий спектр биологически активных соединений, таких как полифенолы (фенольные кислоты, флавоноиды, антоцианы, проантоцианидины) в различных пропорциях [38].Старение непосредственно связано с прогрессирующими нейродегенеративными заболеваниями, включая потерю памяти, болезнь Альцгеймера, а также болезнь Паркинсона [39]. В качестве дрозофилиной модели болезни Альцгеймера использовали линию со сверхэкспрессией бета-амилоида человека Aβ42. Установлено, что у самцов экспериментальной линии elav[c155]-Gal4>UAS-Aβ42 под действием экстракта аронии в концентрации 10 мг/мл медианная продолжительность жизни увеличилась на 2 % (p < 0.00001), а максимальная продолжительность жизни снизилась на 3 % (p < 0.0001). У самок же наблюдали увеличение медианной продолжительности жизни на 10 % (p < 0.00001) и максимальной продолжительности жизни на 11 % (p < 0.0001) (рисунок, таблица). Также отмечали положительное действие обработки экстрактом ягод аронии на контрольные родительские линии. В контрольной родительской линии elav[c155]-Gal4 экстракт аронии увеличил максимальную продолжительность жизни самок на 8 % (p < 0.001), а в контрольной родительской линии UAS-Aβ42 экстракт увеличил максимальную продолжительность жизни самцов на 4 % (p < 0.0001) (рисунок, таблица). В остальных вариантах эксперимента не выявлено статистически значимых различий в показателях продолжительности жизни дрозофил. У родительских линий с отсутствием экспрессии бета-амилоида человека применение экстракта черноплодной рябины не оказало влияния на продолжительность жизни или привело к ее увеличению только у одного пола. Однако у линии с выраженной сверхэкспрессией нейротоксичного бета-амилоида, у которой выживаемость значительно ниже по сравнению с родительскими линиями, экстракт черноплодной рябины вызывает увеличение показателей продолжительности жизни (за исключением максимальной продолжительности жизни самцов). Таким образом, эффект экстракта черноплодной рябины зависит от присутствия бета-амилоида.Ранее обнаружено, что выделенный цианидин 3-O-β-галактозид из черноплодной рябины (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliott), применяемый внутрижелудочно (25 и 50 мг/кг/день), оказывает положительное воздействие на когнитивные функции у стареющих мышей, а именно уменьшает повреждение нейронов в гиппокампе, коре головного мозга, снижает нагрузку β-амилоида в головном мозге и увеличивает число пересечений платформ в тесте водного лабиринта Морриса [40]. Применение 50 мг/кг этанольного экстракта черноплодной рябины (Aronia melanocapa L.) на (LPS)-индуцированной мышиной модели болезни Альцгеймера, уменьшает повреждение тканей в гиппокампе за счет снижения уровней индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), циклооксигеназы 2 (COX-2) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) [41]. В эксперименте с мышами с ускоренным старением (SAMP8) при применении комбинации метформина и цианидин-3-O-β-галактозид (Cy3Gal) из аронии Aronia melanocarpa было выявлено улучшение пространственного обучения и памяти мышей (значительное снижение агрегации бета-амилоида Aβ в головном мозге), по сравнению с контрольной группой [42].В экспериментах на крысах показано, что антоцианы обладают низким всасыванием в желудочно-кишечном тракте (до 20 %) [43–45]. После всасывания антоцианы в основном распределяются в мочевом пузыре и почках крыс [34, 46]. Низкую скорость всасывания антоцианов и других полифенольных соединений в плодах черноплодной рябины можно объяснить их трансформацией, модификацией путем метилирования или конъюгации с глюкуроновой кислотой [34]. Известно, что хлорогеновая и урсоловая кислоты, содержащиеся в экстракте черноплодной рябины, имеют нейропротекторные свойства, а также обладают антиоксидантной активностью, митохондриальной защитой, что говорит о их потенциале при нейродегенеративных заболеваниях, включая болезни Альцгеймера и Паркинсона [47, 48]. Все это может влиять на эффекты, полученные в ходе экспериментов по изучению влияния экстракта черноплодной рябины на продолжительность жизни дрозофил с моделью Альцгеймера. Биомедицинские и демографические исследования показали, что самки живут дольше самцов практически у всех видов животных [49]. Это явление известно как половой разрыв в продолжительности жизни [50]. Что касается дрозофилы, Brown et al. [51] продемонстрировали более высокий уровень смертности у самцов Canton-S по сравнению с самками. Множественные факторы могут влиять или вызывать гендерно-зависимую продолжительность жизни, включая симметричное наследование половых хромосом, генетические различия между полами, различия в физиологии и поведении, материнские эффекты, различия в активности кишечных стволовых клеток и половой отбор, могут быть одними из основных молекулярных механизмов. Известно, что большая часть анаболизма у самок направлена на продукцию яиц [52], а ограничение питания приводит к снижению репродуктивной активности. Также известно, что самцы едят меньше, чем самки [52], что может сказываться при фармакологических и диетических обработках мух. Следовательно, манипуляции с окружающей средой, влияющие на продолжительность жизни, часто оказывают разное влияние на самцов и самок. Так и в нашем исследовании самцы и самки отреагировали по-разному на добавление в рацион экстракта аронии. Однако молекулярные механизмы таких различий в реакции самцов и самок на различные воздействия пока еще до конца не изучены.Заключение В проведенном исследовании было обнаружено, что этанольный экстракт черноплодной рябины (×Sorbaronia mitschurinii) увеличивает продолжительность жизни самок и самцов линии elav[c155]-Gal4>UAS-Aβ42, которая является моделью болезни Альцгеймера у дрозофилы. Экстракт также статистически значимо увеличивает максимальную продолжительность жизни родительских линий самок elav[c155]-Gal4 и самцов UAS-Aβ42. Таким образом, полученные результаты указывают на нейропротекторный потенциал экстракта черноплодной рябины на модели Drosophila melanogaster с повышенным уровнем бета-амилоида человека Aβ42.