Kirov, Kirov, Russian Federation
Analysis of manure biofilm effluents revealed an association of Clostridium ssp. (91.09 %), Escherichia coli (6.07), Bacteroides sp. (1.06), Sarcina ventriculi (0.91), Klebsiella sp. (0.14 %), and yeast Rhodotorula glutinis in the amount of 0.11 % of the total number of microorganisms. The pigmented yeast Rhodotorula glutinis has a low biochemical activity and is resistant to pH changes. In a natural environment (pH 7.0 ±0.3), the amount of Rhodotorula glutinis was 0.11% of the total number of micro- organisms (7*104±2.2 CFU/ml), but with a pH shift to 5.5±0.1 (acidification was carried out with 10 % sulfuric acid solution), the amount of yeast increased to 1.01 % (9*105±1.1 CFU/ml). Yeast of this species retains its viability when the temperature rises, so when heated to 70o C (in bioreactor plants when separating manure effluents), the amount of yeast was 0.06 % of the total microbial community (3*102±1.2 CFU/ml). The detection of yeast Rhodotorula glutinis in pig manure drains has not been described in the domestic and foreign literature before, their role requires further research.
animal waste, manure, Rhodotorula glutinis, biofilms, community of microorganisms
Введение
Органические удобрения на основе отходов животноводства и птицеводства (навоз животных, навозные стоки, помет птиц), содержащие широкий спектр минеральных и органических веществ и служащие питательной средой для различных микроорганизмов, широко используются для повышения плодородия пахотных земель. Периоду внесения удобрений в почву предшествует этап хранения навоза в навозных ваннах, а затем – в лагунах, сопровождающийся микробиологическими процессами. На указанном этапе длительного хранения (6–12 месяцев) навозных стоков (далее – НС), а также внесения их в почву сельскохозяйственных угодий регистрируют максимальное запаховое загрязнение близлежащих территорий, распространяемое с учетом направления ветра на большие расстояния [1, 2]. Наибольший вклад в образование запахообразующих веществ (далее – ЗОВ) вносят гнилостные микроорганизмы, активно развивающиеся в богатом азотистыми соединениями субстрате в условиях дефицита кислорода при рН 7–8.
Микроорганизмы, участвующие в разложении органических компонентов, способны образовывать сообщества как на поверхности НС, формируя микробные пленки (биопленки), так и в толще субстрата. Качественные и количественные характеристики соответствующих микробиологических сообществ и их вклад в эмиссию ЗОВ существенно различаются. Если в толще НС происходит активное продуцирование ЗОВ, то в биопленках – частичное поглощение этих веществ [3–5]. Взаимоотношения между отдельными группами микроорганизмов, обитающими в НС, к настоящему времени изучены весьма поверхностно, что затрудняет разработку и внедрение эффективных технологий снижения запахового загрязнения атмосферы биогенными отходами. Детальные исследования микробного состава биопленок НС могут иметь большое практическое значение, поскольку позволят подобрать оптимальные условия, необходимые для формирования сообществ микроорганизмов, активно поглощающих ЗОВ [1, 6].
Цель нашей работы – исследование микробного состава биопленок свиных навозных стоков и изучение некоторых морфо-биохимических и физико-химических свойств Rhodotorula glutinis.
Материалы и методы
Объектом исследования явились нативные свиные НС из навозных ванн влажностью 99 %, рН 6.8. На протяжении 14 дней НС хранили в закрытых темных емкостях из полиэтилентерефталата объемом 1.5 л. В течение указанного периода на поверхности НС формировалась биопленка из микроорганизмов.
Забор материала биопленки производили в стерильных условиях. Последующие исследования проводили в микробиологической лаборатории, где образцы биоматериала культивировали на стандартных и специальных питательных средах после серийных десятикратных разведений (ОФС.1.7.2.0008.15). В процессе исследований определяли концентрацию микробных клеток (КОЕ/г), идентифицировали отдельные микроорганизмы морфологическими и биохимическими методами. Объем выделившихся газов определяли методом вытеснения жидкости, интенсивность и характер запаха НС оценивали органолептическим методом с привлечением группы экспертов из шести человек по шкале от 0 (запах отсутствует) до трех (интенсивный неприятный запах). Эксперимент проводили в трех повторностях со статистической обработкой результатов.
Результаты и их обсуждение
Общее количество микроорганизмов (далее – ОКМ) в НС составило 65 868 430 КОЕ/мл. Процентное соотношение микробного состава биопленок НС представлено на рисунке.
Согласно полученным результатам, в биопленке НС преобладали анаэробные микроорганизмы Clostridium ssp. (91.09 %), Bacteroides sp. (1.06), Sarcina ventriculi (0.91) и Klebsiella sp. (0.14), а также факультативный аэроб Escherichia coli (6.07) и дрожжи Rhodotorula glutinis (0.11 %). Обнаружение дрожжей рода Rhodotorula в биопленках НС свиней является весьма интересным фактом. Благодаря высокой устойчивости к ультрафиолетовому облучению, эти дрожжи в ряде работ рассматривают в качестве маркеров загрязнения окружающей среды отходами нефти, ртути, хрома и радиоактивными элементами [7], что не характерно для НС.
Дрожжи рода Rhodotorula glutinis идентифицировали по характерным оранжево-красным колониям при культивировании на декстрозном агаре Сабуро. При микроскопии отмечали почкующиеся округлые и овальные клетки размерами 2.5–6.0 × 4.0–8.5 мкм, образующие капсулу. Способность к образованию баллистоспор и псевдомицелия отсутствовала. Наличие истинного мицелия и телиоспор в монокультуре и ассоциациях с другими микроорганизмами не зафиксировано.
В ходе биохимических исследований нами отмечена медленная ферментация дрожжами глюкозы, мальтозы, мелецитозы, L-арабинозы, сорбита, рамнозы, маннита, этанола на фоне полного отсутствия усвоения лактозы, эритрита, дульцита, инозита, глюкуроната. Дрожжи слабо используют нитраты, нитриты, лизин, этиламин, не образуют крахмалоподобные вещества.
Согласно нашим исследованиям, Rhodotorula glutinis устойчива к изменениям рН, а также сохраняет свою жизнеспособность при повышении температуры. Так, в нейтральной среде (рН 7.0±0.3) количество Rhodotorula glutinis составило 0.11 % от общего числа микроорганизмов (7*104±2.2 КОЕ/мл), а при снижении рН до 5.5±0.1 (подкисление проводили 10 %-ным раствором серной кислоты) количество дрожжей выросло почти в 10 раз – до 1.01 % (9*105±1.1 КОЕ/мл).
В подкисленных НС выделение газообразных продуктов снизилось на 35 %, а интенсивность неприятного запаха НС уменьшилась в три раза. Соответствующий эффект можно объяснить подавлением жизнедеятельности гнилостных микроорганизмов в кислой среде и повышенной устойчивостью дрожжей к наличию в субстрате кислот.
Дрожжи способны сохранять свою жизнеспособность при нагревании до 70 оС. Такие условия реализуются в биореакторных установках при сепарировании НС. Согласно полученным результатам, количество дрожжей в обработанных на соответствующей установке НС, составило 0.06 % от общего числа сохранивших жизнеспособность микроорганизмов (3*102±1.2 КОЕ/мл).
Дрожжи рода Rhodotorula (rhodos – красный, torula – выпуклость) [8] представляют существенный практический интерес. Согласно литературным данным, Rhodotorula glutinis способна синтезировать олеиновую, линолевую и пальмитиновую кислоты, поэтому может найти применение в качестве биодизеля третьего поколения [9]. Благодаря синтезу каротиноидов (β-каротин, торулен и торулародин), дрожжи перспективны в качестве кормовых добавок животным, рыбе и ракообразным, а за счет продукции фермента фенилаланин-аммиак-лиазы Rhodotorula glutinis могут использоваться для производства аминокислоты фенилаланина – субстрата для синтеза подсластителя аспартама [10, 11]. Rhodotorula glutinis способны метаболизировать полициклические ароматические углеводороды, таким образом снижая экологическую нагрузку на окружающую среду [12]. По данным официальной статистики, поголовье свиней в РФ в хозяйствах всех категорий достигло 26 192,9 тыс. голов (на конец 2021 г.), а ежегодное количество образующихся НС приблизилось к 96 млн т. Возможность использования НС в качестве питательной среды для культивирования Rhodotorula glutinis может быть одним из направлений утилизации отходов животноводства, что позволит использовать НС свиноферм в качестве питательного субстрата.
Выводы
В составе биопленок свиных навозных стоков в ассоциации с Clostridium ssp., Bacteroides sp., Sarcina ventriculi, Klebsiella sp., Escherichia coli, Rhodotorula glutinis, Staphylococcus epidermidis, Proteus ssp., Peptostreptococcus anaerobius, Saccharomyces cerevisiae, Bifidobacterium ssp. были выявлены дрожжи рода Rhodotorula glutinis.
Доля дрожжей Rhodotorula glutinis в нативных НС (рН 7) оказалась весьма незначительной (0.11 % от общей численности микроорганизмов). Биохимическая активность дрожжей низкая. Подкисление НС (до рН 5.5) привело к увеличению численности этих дрожжей практически в 10 раз. Параллельно с возрастанием численности Rhodotorula glutinis наблюдается снижение эмиссии ЗОВ в атмосферу. Таким образом, прием подкисления можно использовать не только для стимулирования жизнедеятельности дрожжей, но и для снижения интенсивности запахового загрязнения воздуха. Обработка НС в биореакторных установках при температуре 70 оС приводит к сокращению численности Rhodotorula glutinis, однако дрожжи полностью не погибают и сохраняют способность к размножению.
Выявление дрожжей Rhodotorula glutinis требует дальнейших исследований в виде изучения роста монокультур в НС и может рассматриваться как в направлении защиты окружающей среды от супертоксикантов, так и в биотехнологических изысканиях для получения каротиноидных пигментов, ненасыщенных жирных кислот и ферментов.
1. Pilip, L.V. Ekologicheskaya problema otrasli svinovodstva [The environmental problem of the pig industry] / L.V. Pilip, N.V. Syrchina // Agrarnaja nauka - sel’skomu hozjajstvu: sbornik materialov XIV Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii [Agrarian science - agriculture: collection of materials of the XIV International scientific and practical conference]. - 2019. - P. 193 - 196.
2. Syrchina, N.V. Kontrol zapakhovogo zagryazneniya atmosfernogo vozdukha (obzor) [Control of odor pollution of atmospheric air (review)] / N.V. Syrchina, L.V. Pilip, T.Ya. Ashihmina // Teoreticheskaja i prikladnaja jekologija [Theoretical and Applied Ecology]. - 2022. - № 2. - P. 26 - 34.
3. Potekhina, N.V. Bioplenki kak bazovaya forma sushchestvovaniya mikroorganizmov [Biofilms as the basic form of existence of microorganisms] / N.V. Potekhina. - Moskow: Max-Press, 2021. - 76 p.
4. Nozhevnikova, A.N. Multi-species biofilms in ecology, medicine, and biotechnology / A.N. Nozhevnikova, E.A. Botchkova, V.K. Plakunov // Microbiology. - 2015. - Vol. 84, № 6. - P. 731 - 750.
5. Pilip, L.V. Vliyanie podkisleniya navoznykh stokov na ikh mikrobiologicheskie kharakteristiki [The influence of acidification of manure runoff on their microbiological characteristics] / L.V. Pilip, V.A. Kozvonin, N.V. Syrchina [et al.] // Teoreticheskaja i prikladnaja jekologija [Theoretical and Applied Ecology]. - 2020. - № 3. - P. 161-167.
6. Pilip, L.V. Novye podkhody k dezodoratsii svinogo navoza [New approaches to the deodorization of pig manure] / L.V. Pilip, N.V. Syrchina // Ippologija i veterinarija [Hippology and veterinary]. - 2018. - № 4 (30). - P. 99-106.
7. Krzyściak P. Występowanie i chorobotwórczość grzybów Rhodotorula spp. / P. Krzyściak, A. Halska, A. Macura // Post Mikrobiol. - 2007. - N 46. - P. 291-300.
8. Saenge, C. Efficient concomitant production of lipids and carotenoids by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis cultured in palm oil mill effluent and application of lipids for biodiesel production / C. Saenge, B. Cheirsilp, T. T. Suksaroge [ey al.] // Biotechnol. Bioprocess Engineering. - 2011. - Vol. 16, N. 1. - P. 23-33.
9. Li C. J. Genomics and lipidomics analysis of the biotechnologically important oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis ZHK provides new insights into its lipid and carotenoid metabolism / C. J. Li, D. Zhao, P. Cheng // BMC Genomics. - 2020. - N 21. - P. 834.
10. Qiang L. Perspectives of microbial oils for biodiesel production / L. Qiang, D. Wei , D. Liu // Applied Microbiol. Biotechnol. - 2008. - Vol. 80. - P. 749-756.
11. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries / A. M. Kot, S. Błażejak, A. Kurcz [et al.] // Applied Microbiol. Biotechnol. - 2016. - Vol. 100. - P. 6103-6117.
12. Krupey K. S. Bioindication capabilities of pigment-synthesizing yeasts of the genus Rhodotorula / K. S. Krupey // Australian J. Sci. Res. - 2014. - Vol. III, N 1(5). - P. 249-254.
