Россия
Россия
Криосохранение генетического материала высокопродуктивных пород крупного рогатого скота актуально на протяжении нескольких десятилетий. Основной целью экспериментов является разработка криконсервантов, сохраняющих сперму в функционально-активном состоянии. Для этого в состав криопротекторов вводят различные антиоксиданты и сахара. Цель настоящей работы – изучение влияния полисахаридных фракций H. erinaceus на криоустойчивость спермы быков. В ходе работы выявлено, что растворы, содержащие полисахаридные фракции H. erinaceus, сохраняют более высокий уровень показателей подвижности, чем контрольный раствор. Необходимо дальнейшее исследование полисахаридов в сохранении репродуктивной функции клеток, в том числе на более длительные сроки.
полисахариды, криоустойчивость, замораживание, сперматозоиды
Введение
Криосохранение спермы высокопродуктивных пород крупного рогатого скота актуально на протяжении нескольких десятилетий. Известно, что любое воздействие на сперму в процессе ее замораживания-оттаивания изменяет структуру (уменьшаются размеры сперматозоидов, особенно площадь и периметр головки) и биохимические свойства гамет [1–4]. Стандартный метод криоконсервации включает замораживание спермы в парах жидкого азота до -80° C на высоте 1–10 см и последующее хранение при -196° C [5]. Основной целью большинства экспериментов по криоконсервированию спермы является разработка крио-
протекторных растворов, в состав которых могут быть включены антиоксиданты, сахара, витамины, экстракты растений для сохранения или восстановления морфологии, жизнеспособности, подвижности, а также целостности мембран, акросом и ДНК гамет. В настоящей работе в качестве антиоксиданта мы применили полисахаридные фракции Hericium Erinaceus. Известно, что препараты, полученные на основе полисахаридного комплекса H. Erinaceus, обладают антиоксидантным [6–8], гепатопротекторным [9, 10], гиполипидемическим [11], антимикробным [12, 13], противоопухолевым [8, 14–16], иммуномодулирующим [17], гастропротекторным [18–20], нейропротекторным [21–23] и другими видами физиологических действий. Важной особенностью полисахаридов H. Erinaceus является наличие в его молекуле функциональных групп, которые взаимодействуют с молекулами глицерина, образуя водородные связи, что позволяет достичь наибольшей эффективности раствора для сохранения функций сперматозоидов.
Цель нашей работы – изучение влияния полисахаридных фракций H. Erinaceus на криоустойчивость спермы.
Материалы и методы
Культивирование и получение плодовых тел H. Erinaceus
В работе использовали штамм H. Erinaceus BP16 (нуклеотидная последовательность фрагмента ITS1_5.8S_ITS2 депонирована в NCBI под номером MK809367), полученный методом культуры ткани из собранного в природе плодового тела гриба, выращенного на лигноцеллюлозном субстрате, состоящем из дубовых опилок, зерна овса и соломы (1:3:6 об. %) в стеклянных емкостях объемом 500 мл. Для этого в стерилизованный автоклавированием (121° С, 1 атм., в течение 25 мин) субстрат после охлаждения асептически вносили блоки (ø 10 мм, 2 шт./емкость) с грибным мицелием, вырезанные из 15-суточной газонной культуры на сусло-агаре (4° С). Емкости с инокулированным субстратом инкубировали при комнатной температуре (20±1° С) и естественном световом режиме. По мере формирования грибом плодовых тел их срезали и высушивали при 60° С в сушильном шкафу (СМ 50/400-60 ШС, Россия) или замораживали при -20° С в электроморозильнике «Derby» (Дания).
Получение полисахаридных фракций из плодовых тел H. erinaceus
Навески измельченных сухих и замороженных плодовых тел подвергали экстракции по отдельности. Сырье заливали последовательно водой при +20° и +70° С, затем 5%-ным водным раствором NaOH при +20° С. На всех этапах осуществляли непрерывное перемешивание в течение 3 ч. Остаток сырья отделяли центрифугированием. Контроль экстракции полисахаридов выполняли фенол-сернокислотным методом [24]. При положительной реакции на углеводы экстракт сливали, а остаток сырья повторно заливали экстрагентом (водой или 5%-ным раствором NaOH), повторяя манипуляцию до отрицательной реакции на углеводы в экстракте. Методом центрифугирования (13 тыс.об/мин, в течение 40 мин) получали супернатант с последующим высушиванием. Получены две полисахаридные фракции: из замороженных плодовых тел – PF1, из сухих плодовых тел – PF2.
Определение химического состава полисахаридных фракций PF1 и PF2
Количественное определение нейтральных моносахаридов в виде соответствующих ацетатов полиолов после полного (в течение 3 ч) кислотного гидролиза фракций 2М трифторуксусной кислотой проводили газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ). Использовали хроматограф «Varian 450-GC» (США) с пламенно-ионизационным детектором, капиллярную колонку VF-5 ms «Varian» (США), 0,25 мм, 30 м, гелий в качестве газа-носителя. Газожидкостную хроматографию ацетатов полиолов осуществляли в программе: от 175° (1 мин) до 250° C (2 мин) со скоростью 3° C/мин. Процентное содержание моносахаридов от суммарного препарата вычисляли из площадей пиков, используя коэффициенты отклика детектора [25]. В качестве внутреннего стандарта применяли мио-инозит «Sigma» (США).
В полисахаридных фракциях, помимо моносахаридного состава, определяли содержание уроновых кислот спектрофотометрическим методом, основанным на реакции продуктов окисления углеводов с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты, с использованием градуировочного графика, построенного для растворов галактуроновой кислоты. Измерение проводили при двух длинах волн 400 и 450 нм на спектрофотометре UNICO 2800 (США) [22].
Содержание белка определяли по методу Лоури [26], используя градуировочный график, построенный для растворов бычьего сывороточного альбумина.
Сбор спермы
Быки-производители голштинской породы (n=20; возраст – 2-3 года) - постоянные доноры спермы, содержались на предприятии ОАО «КировПлем» (Россия). Условия содержания были оптимальными и одинаковыми для каждого быка. Сперму собирали с использованием искусственного влагалища (+42° С).
Охлаждение и отогрев сперматозоидов
Свежеполученную сперму делили на три экспериментальные группы. Контрольную группу (КГ) разбавляли в соотношении 1:5 с раствором в составе (вес/объем): 2,75 г ТРИС (AppliChem, Германия), 0,8 г – глюкоза (NeoFroxx, Германия), 0,3 г – мальтоза (NeoFroxx, Германия), 1,4 – лимонная кислота (CDH, Индия), 6 мл – глицерин (АО Химреактив, Россия), 20 мл – желток куриный, бидистиллированная вода до 100 мл. При приготовлении растворов для экспериментальных групп (ЭГ1 и ЭГ2) к указанному составу раствора добавляли по 0,25 г PF1 или 0,25 г PF2 и в дальнейшем также смешивали со спермой в соотношении 1:5. Далее для оценки криозащитных свойств полисахаридных фракций смесь разливали по криопробиркам по 500 мкл и помещали в воздушную среду холодильника ТВЛ-К 050Б (ЗАО «ИнСовт», Россия) при температуре +5° С на 2 ч, после чего переносили в электрический морозильник Vestfrost (Дания) при температуре –80° С для хранения. Отогрев осуществляли в водяной ванне при +37° С после семи суток хранения.
Определение подвижности сперматозоидов
До охлаждения и после отогрева проводили анализ биологических параметров спермы с помощью програм-
много обеспечения Аргус-CASA, которая включала фазово-контрастный микроскоп (CX43RF Olympus, Япония), программное обеспечение, цифровую камеру, ПК, укомплектованный принадлежностями. Для этого каплю спермы вносили в счетную камеру Маклера (Counting chamber Makler®, Sefi Medical, Israel) и исследовали в фазово-контрастном свете.
Для расчета показателей подвижности сперматозоидов рассматривали только прогрессивно подвижные клетки как основной объект дальнейших исследований.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с использованием программного комплекса XLSTAT 2016. Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка (при числе исследуемых – менее 50) или критерия Колмогорова-Смирнова (при числе исследуемых – более 50). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывали с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3). Сравнение по показателю статистической значимости оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса при р<0,05. Результаты исследования представлены в виде медианы и 25-го и 75-го центилей (Ме, Q1-Q3).
Результаты и их обсуждение
Подвижность сперматозоидов является одним из наиболее важных показателей фертильности [27]. Оценивали следующие показатели подвижности: прямолинейная скорость VSL (микрон/сек), криволинейная скорость VCL (микрон/сек), средняя скорость пути VAP (микрон/сек), среднее угловое смещение MAD (град), линейность LIN (%), перекрестная частота биений BCF (Гц). Оценивали не менее 200 сперматозоидов по каждому параметру подвижности из предусмотренных протоколом исследования программы AprycCASA.
Смешивание спермы с исследуемыми растворами перед криоконсервацией вызывает изменение различных показателей кинематики. Так, значения показателей VSL, VCL, BCF в группе ЭГ1 статистически значимо выше, чем в группе КГ, а показателей VAP и BCF – выше, чем в группе ЭГ2 (табл. 1).
После хранения сперматозоидов при –80 °С в течение семи суток данные группы КГ (без полисахаридных фракций) статистически значимо отличались от ЭГ1 и ЭГ2 по следующим параметрам подвижности: от ЭГ1 – MAD и LIN, от ЭГ2 – VCL, MAD, BCF.
Таким образом, экспериментальные растворы, содержащие полисахаридные фракции H. Erinaceus, сохраняют более высокий уровень показателей подвижности, чем контрольный раствор. Данный эффект можно проследить как непосредственно после смешивания спермы с растворами, так и после низкотемпературного хранения. Мы полагаем, что это достигается за счет формирования водородных связей между гидроксильными группами полисахарида и глицерина, а также благодаря наличию антиоксидантной активности у полисахаридных фракций H. erinaceus. Необходимо дальнейшее исследование полисахаридов в сохранении репродуктивной функции клеток, в том числе на более длительные сроки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
1. Thompson, L. A. A morphometric comparison of the nuclear morphology of fresh and frozen-thawed human zona-bound and unbound sperm / L. A. Thompson, P. F. Brook, M. A. Warren [et al.] // Journal of Andrology. – 1994. – Vol. 15. – № 4. – P. 337–342.
2. Gravance, C. G. Pre-freeze bull sperm head morphometry related with post-thaw fertility/ C. G. Gravance, M. E. Casey, P. J. Case // Animal Reproduction Science. – 2009. – Vol. 114. – P. 81–88.
3. Pena, F. J. Identification of sperm morphometric subpopulations in two different portions of the boar ejaculate and its relation to post thaw quality / F. J. Pena, F. Saravia, M. García-Herreros [et al.] // Journal of Andrology. – 2005. – Vol. 26. – P. 716–723.
4. Li, X. Y. In vitro antioxidant and anti-proliferation activities of polysaccharides from various extracts of different mushrooms / X. Y. Li, Z. Wang, L. Wang [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. – 2012. – Vol. 13. – № 5. – P. 5801–5817.
5. Le, M. T. Cryopreservation of human spermatozoa by vitrification versus conventional rapid freezing: Effects on motility, viability, morphology and cellular defects / M. T. Le, T. T. Thanh Nguyen, T. T. Nguyen [et al.] // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. – 2019. – Vol. 234. – P.14–20.
6. Liu, J. Anti-fatigue activities of polysaccharides extracted from Hericium erinaceus / J. Liu, C. Du, Y. Wang [et al.] // Experimental and Therapeutic Medicine. – 2015. – Vol. 9. – № 2. – P. 483–487.
7. Han, Z. H. Evaluation of in vivo antioxidant activity of Hericium erinaceus polysaccharides / Z. H. Han, J. M. Ye, G. F. Wang // International Journal of Biological Macromolecules. – 2013. – Vol. 52. – P. 66–71.
8. Liu, J. Y. Isolation and structural characterization of a novel polysaccharide from Hericium erinaceus fruiting bodies and its arrest of cell cycle at S-phage in colon cancer cells / J. Y. Liu, X. X. Hou, Z. Y. Li [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. – 2020. – Vol. 157. – P. 288–295.
9. Zhang, Z. Antioxidant and hepatoprotective potential of endo-polysaccharides from Hericium erinaceus grown on tofu whey / Z. Zhang, G. Lv, H. Pan [et al.] // International Journal of Biological Macromolecules. – 2012. – Vol. 51. – № 5. – P. 1140–1146.
10. Cui, F. Protective effects of extracellular and intracellular polysaccharides on hepatotoxicity by Hericium erinaceus SG-02 / F. Cui, X. Gao, J. Zhang [et al.] // Current Microbiology. – 2016. – Vol. 73. – № 3. – P. 379–385.
11. Yang, B. K. Hypolipidemic effect of an exo-biopolymer produced from a submerged mycelial culture of Hericium erinaceus / B. K. Yang, J. B. Park, C. H. Song // Bioscience Biotechnology and Biochemistry. – 2003. – Vol. 67. – № 6. – P. 1292–1298.
12. Kim, S. P. Hericium erinaceus mushroom extracts protect infected mice against Salmonella Typhimurium – induced liver damage and mortality by stimulation of innate immune cells / S. P. Kim, E. Moon, S. H. Nam [et al.] // Journal of Agricultural and Food Chemistry. – 2012. – Vol. 60. – № 22. – P. 5590–5596.
13. Kim, D. M. Isolation of antimicrobial substances from Hericium erinaceum / D. M. Kim, C. W. Pyun, H. G. Ko [et al.] // Mycobiology. – 2000. – Vol. 28. – P. 33–38.
14. Li, G. Anticancer potential of Hericium erinaceus extracts against human gastrointestinal cancers / G. Li, K. Yu, F. Li [et al.] // Journal of Ethnopharmacology. – 2014. – Vol. 153. – № 2. – P. 521–530.
15. Wang, J. C. Antitumor and immunoenhancing activities of polysaccharide from culture broth of Hericium spp. / J. C. Wang, S. H. Hu, C. H. Su [et al.] // Kaohsiung Journal of Medical Sciences. – 2001. – Vol. 17. – № 9. – P. 461–467.
16. Yonis, A. Anticancer potential of Hericium erinaceus extracts against particular human cancer cell lines / A. Yonis // Microbial Biosystems. – 2017. – Vol. 2. – № 1. – P. 9–20.
17. Choi, Y. I. Immuno-stimulating and antitumor effects on mouse sarcoma 180 by crude polysaccharides extracted from fruiting body of Hericium erinaceus / Y. I. Choi, J. S. Lee, U. Y. Lee [et al.] // Journal of Life Science. – 2010. – Vol. 20. – P. 623–631.
18. Wang, M. M. Anti-gastric ulcer activity of polysaccharide fraction isolated from mycelium culture of lion’s mane medicinal mushroom, Hericium erinaceus (higher basidiomycetes) / M. M. Wang, T. Konishi, Y. Gao [et al.] // International Journal of Medicinal Mushrooms. – 2015. – Vol. 11. – P. 1055–60.
19. Wang, X. Y. Gastroprotective activity of polysaccharide from Hericium erinaceus against ethanol-induced gastric mucosal lesion and pylorus ligation-induced gastric ulcer, and its antioxidant activities / X. Y. Wang, J. Y. Yin, M. M. Zhao [et al.] // Carbohydrate Polymers. – 2018. – Vol. 186. – P. 100–1099.
20. Golbabapour, S. Gastroprotective effects of lion’s mane mushroom Hericium erinaceus (bull.:Fr.) Pers. (Aphyllophoromycetideae) extract against ethanol-induced ulcer in rats / S. Golbabapour, V. Sabaratnam // Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. – 2013. – Vol. 3. – P. 1–9.
21. Wong, K. H. Restoration of sensory dysfunction following peripheral nerve injury by the polysaccharide from culinary and medicinal mushroom, Hericium erinaceus (bull.:Fr.) Pers. through its neuroregenerative action / K. H. Wong, G. Kanagasabapathy, R. Bakar [et al.] // Food Science and Technology. – 2015. – Vol. 35. – № 4. – P. 712–721.
22. Zhang, J. The neuroprotective properties of Hericium erinaceus in glutamate-damaged differentiated PC12 cells and an Alzheimer’s disease mouse model / J. Zhang, S. An, W. Hu [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. – 2016. – № 17 (11). – P. 1–13.
23. Usov, A. I. Polysaccharides of the red algae / A. I. Usov // Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. – 2011. – Vol. 65. – P. 115–217.
24. Dubois, M. Calorimetric method for the determination of sugars and related substances / M. Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton [et al.] // Analytical Chemistry. – 1956. – Vol. 28. – P. 350–356.
25. York, W. S. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components / W. S. York, A. G. Darvil, M. R. McNeil [et al.] // Methods in Enzymology. – 1986. – Vol. 118. – P. 3–40.
26. Lowry, O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. – 1951. – Vol. 193. – № 1. – P. 265–75.
27. Bergeron, A. New insights towards understanding the mechanisms of sperm protection by egg yolk and milk / A. Bergeron, P. Manjunath // Molecular Reproduction and Development. – 2006. – Vol. 73. – № 10. – P. 1338–1344.
